枯草芽孢桿菌是革蘭氏陽性細(xì)菌的模式菌株之一，是常見的桿狀細(xì)菌，能產(chǎn)生芽孢，廣泛存在于土壤等自然環(huán)境中。因?yàn)槠渚昊蚪M測序及必需基因解析較為清晰，枯草芽孢桿菌常被用作細(xì)菌遺傳學(xué)及細(xì)胞代謝研究的模式菌株。除此之外，枯草芽孢桿菌菌株安全性強(qiáng)，被美國食品藥品監(jiān)督局(US Food and Drug Administration，F(xiàn)DA) 認(rèn)定是公認(rèn)的安全菌株(Generally recognized as safe，GRAS)。因?yàn)閾碛猩砩卣髑逦z傳操作較為簡單，分泌及表達(dá)能力強(qiáng)，培養(yǎng)發(fā)酵較為方便等優(yōu)點(diǎn)，枯草芽孢桿菌還作為優(yōu)良的底盤細(xì)胞，被改造為微生物細(xì)胞工廠，用于生產(chǎn)工業(yè)酶、維生素、功能糖、保健品及藥物前體等目標(biāo)產(chǎn)物，表現(xiàn)出了強(qiáng)大的工業(yè)生產(chǎn)應(yīng)用能力。

安必奇擁有成熟的重組表達(dá)和純化技術(shù)，配備了不同規(guī)格的發(fā)酵罐，以及高密度微生物發(fā)酵技術(shù)平臺(tái)，滿足不同的產(chǎn)量要求。我們可以構(gòu)建和篩選枯草芽孢桿菌底盤，進(jìn)行發(fā)酵工藝開發(fā)，包括基礎(chǔ)培養(yǎng)基篩選、補(bǔ)料培養(yǎng)基優(yōu)化及篩選，評估和優(yōu)化關(guān)鍵發(fā)酵工藝參數(shù)、建立控制策略，還能實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的下游純化，純化方法包括親和純化、離子交換、分子篩、疏水和反相等。

基于CRISPR-Cas系統(tǒng)多位點(diǎn)、多維度動(dòng)態(tài)調(diào)控枯草芽孢桿菌底盤細(xì)胞

• 通過應(yīng)用優(yōu)化的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng)，可以進(jìn)行基因組的多位點(diǎn)基因編輯。上調(diào)或下調(diào)體內(nèi)不同基因，可對底盤細(xì)胞進(jìn)行多基因、催化途徑的多反應(yīng)步驟的調(diào)控，全面優(yōu)化底盤細(xì)胞。

• 利用生物傳感器建立枯草芽孢桿菌的動(dòng)態(tài)調(diào)控。 通過應(yīng)用針對小分子的生物傳感器，或?qū)⑸飩鞲衅髋cCRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng)相結(jié)合，調(diào)節(jié)下游基因，可以動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)體內(nèi)碳流，平衡細(xì)胞內(nèi)的生長和生產(chǎn)。

• 利用CRISPR-dCas9系統(tǒng)進(jìn)行多維調(diào)控。 優(yōu)化CRISPR-dCas9基因編輯系統(tǒng)用于篩選蛋白質(zhì)表達(dá)啟動(dòng)子文庫、上調(diào)新生肽蛋白質(zhì)折疊分子伴侶、抑制和消除蛋白酶表達(dá)。通過轉(zhuǎn)錄、折疊和修飾以及蛋白質(zhì)成熟度的上調(diào)和保護(hù)來增強(qiáng)蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。

平臺(tái)設(shè)施

枯草芽孢桿菌發(fā)酵服務(wù)

安必奇提供枯草芽孢桿菌全面的構(gòu)建和發(fā)酵生產(chǎn)服務(wù)。我們可以從客戶提供的DNA或蛋白質(zhì)序列開始，到交付出高產(chǎn)量、高品質(zhì)且穩(wěn)定的菌種庫，以及滿足不同應(yīng)用需求的終產(chǎn)物。

? 菌株構(gòu)建

定制化構(gòu)建枯草芽孢桿菌基因工程菌株（基因優(yōu)化、表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建、陽性菌株篩選、高拷貝菌株篩選、工程菌株優(yōu)化），得到的高產(chǎn)菌株易于進(jìn)行工業(yè)化發(fā)酵，生產(chǎn)能力強(qiáng)，可以降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟(jì)效益。

? 發(fā)酵優(yōu)化

發(fā)酵條件的優(yōu)化（培養(yǎng)基及補(bǔ)料優(yōu)化，溶氧量、溫度、pH值控制）
大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)

? 純化工藝優(yōu)化

通過疏水、親和、凝膠過濾色譜、離子交換等純化方式可獲得純度大于95%的目標(biāo)產(chǎn)物。

? 凍干工藝優(yōu)化

凍干過程包括三個(gè)階段：（1）冷凍階段，（2）初級干燥階段和（3）二次干燥階段。對多種條件下冷凍干燥試驗(yàn)過程中的關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，在不影響凍干制品質(zhì)量的前提下（保證低的水分含量、具備優(yōu)良的產(chǎn)品外觀），縮短凍干工藝的周期。

枯草芽孢桿菌發(fā)酵服務(wù)優(yōu)勢

安必奇擁有豐富的蛋白表達(dá)經(jīng)驗(yàn)，枯草芽孢桿菌表達(dá)體系成熟，可從基因優(yōu)化、工程菌株的篩選、表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建，以及小試條件探索到放大發(fā)酵條件優(yōu)化的完整試驗(yàn)?zāi)芰Γ軌驗(yàn)榭蛻籼峁└哔|(zhì)量、定制化的技術(shù)服務(wù)。

• 不斷完善的基因組、轉(zhuǎn)錄組等代謝網(wǎng)絡(luò)解析技術(shù)

• 生化合成新途徑的設(shè)計(jì)和新酶的挖掘

• 開發(fā)與優(yōu)化基因編輯工具，實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)基因編輯效率的提高

• 結(jié)合高通量基因克隆組裝與高通量篩選技術(shù)，實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量的底盤細(xì)胞改造流程

• 開發(fā)基于胞內(nèi)傳感器的自調(diào)節(jié)系統(tǒng)

枯草芽孢桿菌發(fā)酵應(yīng)用

枯草芽孢桿菌是一種具有研究開發(fā)潛力的微生物菌種，菌體自身合成α-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、麥芽糖酶、植酸酶、纖維素酶等酶類，也能合成維生素B1、B2、B6、煙酸等多種B族維生素，還可以產(chǎn)生枯草菌素、短桿菌肽等活性物質(zhì)。因其代謝產(chǎn)物的多功能性，枯草芽孢桿菌目前已在生物農(nóng)藥和生物肥料領(lǐng)域初步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化，也在農(nóng)林植物培育與保護(hù)、畜牧飼料、食品加工、環(huán)境保護(hù)等眾多領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

服務(wù)案例

案例1：

重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)乳鐵蛋白及工藝優(yōu)化

• 菌株構(gòu)建

實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建重組枯草芽孢桿菌工程菌。

• 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基
發(fā)酵培養(yǎng)基：TB培養(yǎng)基

• 發(fā)酵培養(yǎng)

菌種活化
搖瓶培養(yǎng)
重組菌株發(fā)酵培養(yǎng)

• 發(fā)酵條件優(yōu)化

（1）考察不同種類的碳氮源對重組菌株生長和目的蛋白表達(dá)的影響，選取葡萄糖和胰蛋白胨作為碳氮源用于后續(xù)發(fā)酵。

（2）摸索pH值，綜合菌體的生長和目的蛋白的表達(dá)結(jié)果，在發(fā)酵前7 h內(nèi)將培養(yǎng)基的pH調(diào)節(jié)至7.5，以利于重組菌的生長，在7?16 h時(shí)，即發(fā)酵進(jìn)入后期階段將pH調(diào)節(jié)至7.0，以利于牛乳鐵蛋白的積累。
（3）考慮菌體的生長條件（37 ℃）和牛乳鐵蛋白表達(dá)量的適宜溫度（28 ℃），選取28 ℃作為誘導(dǎo)溫度。
（4）比較后選擇25 h作為發(fā)酵時(shí)間。

• 響應(yīng)面優(yōu)化重組菌株發(fā)酵工藝試驗(yàn)

• 重組菌株10 L罐的發(fā)酵工藝優(yōu)化

（1）采用分段控制轉(zhuǎn)速的方式，在發(fā)酵前期主要考慮菌體的生長，而發(fā)酵后期主要兼顧目的蛋白的積累量。
（2）發(fā)酵前期采用30 ℃培養(yǎng)，在發(fā)酵后期采用28 ℃表達(dá)目的蛋白。
（3）設(shè)計(jì)二段式溫度、pH對菌體生長和蛋白產(chǎn)量的調(diào)控實(shí)驗(yàn)。二段式發(fā)酵工藝優(yōu)化使得牛乳鐵蛋白表達(dá)量提高了2倍以上。

案例2：

枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)聚-γ-谷氨酸

聚-γ-谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是微生物（主要為芽孢桿菌類）發(fā)酵的產(chǎn)物，由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）單體通過 γ-酰胺鍵聚合而成的一種陰離子高分子型聚合物。它的基本碳骨架分子呈直鏈型，主鏈上存在著大量的氫鍵、肽鍵和游離羧基，使γ-PGA具有水溶性、生物相容性和生物降解性能。另外，游離羧基使γ-PGA具有大量的活性位點(diǎn)，可發(fā)生交聯(lián)、螯合、衍生化等反應(yīng)，便于材料的功能化，易與其它材料聚合形成新型復(fù)合材料，使γ-PGA在醫(yī)藥、食品及化妝品、污水處理和農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域顯示出廣闊的應(yīng)用前景。微生物發(fā)酵法具有條件溫和、周期短、γ-PGA產(chǎn)量高且分子量分布合適等優(yōu)點(diǎn)。我們對枯草芽孢桿菌的生產(chǎn)條件進(jìn)行了優(yōu)化，以提高γ-PGA產(chǎn)量和生產(chǎn)強(qiáng)度，降低其生產(chǎn)成本，為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支撐。

接種量（a）、初始pH（b）、培養(yǎng)溫度（c）、發(fā)酵時(shí)間（a, b）對 γ-PGA產(chǎn)量的影響

通過對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的組合，γ-PGA產(chǎn)量達(dá)到20.8 g/L，比優(yōu)化前提高了31.65%，適合工業(yè)化生產(chǎn)需要。

案例3：

VP28-cMyc-cwlCc 在B. subtilis 168 中的表達(dá)
(1) 目的基因合成與克隆
(2) 枯草芽孢桿菌168感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化
(3) 陽性克隆篩選
(4) 表達(dá)式驗(yàn)證
(5) 陽性克隆擴(kuò)增

PCR驗(yàn)證

Western Blot 檢測蛋白表達(dá)

使用 Dot-Blot 檢測蛋白質(zhì)展示

參考文獻(xiàn)：

• JIN L, LI LH, ZHANG RZ, et al. Fermentation optimization for production of lactoferrin N-lobe by recombinant Bacillus subtilis. Chinese Journal of Biotechnology, 2022, 38(7): 2628-2638.