原核發(fā)酵應(yīng)用于許多工業(yè)環(huán)境，包括生物制藥、食品和飼料、化學(xué)品和生物燃料的制造。在生物制藥行業(yè)，原核微生物是生產(chǎn)質(zhì)粒、蛋白質(zhì)、肽和小分子等治療藥物的工具。其中，大腸桿菌表達系統(tǒng)是經(jīng)濟實用的原核表達系統(tǒng)，具有遺傳背景清楚、易于培養(yǎng)和控制、轉(zhuǎn)化操作簡單、表達水平高、成本低、周期短等優(yōu)點。
圖1 大腸桿菌工程菌商業(yè)化生產(chǎn)目標(biāo)產(chǎn)物
服務(wù)項目
? 菌株構(gòu)建
安必奇提供大腸桿菌基因工程菌株的定制化構(gòu)建服務(wù)，得到的高產(chǎn)菌株易于進行工業(yè)化發(fā)酵，生產(chǎn)能力強，可以降低生產(chǎn)成本，提高經(jīng)濟效益。
? 發(fā)酵優(yōu)化
發(fā)酵條件的優(yōu)化（培養(yǎng)基及補料優(yōu)化，溶氧量、溫度、pH值控制）
大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)
? 純化工藝優(yōu)化
通過疏水、親和、凝膠過濾色譜、離子交換等純化方式可獲得純度大于95%的目標(biāo)蛋白。
? 凍干工藝優(yōu)化
凍干過程包括三個階段：（1）冷凍階段，（2）初級干燥階段和（3）二次干燥階段。對多種條件下冷凍干燥試驗過程中的關(guān)鍵參數(shù)進行優(yōu)化，在不影響凍干制品質(zhì)量的前提下（保證低的水分含量、具備優(yōu)良的產(chǎn)品外觀），縮短凍干工藝的周期。
平臺設(shè)施
大腸桿菌發(fā)酵應(yīng)用
大腸桿菌質(zhì)粒生產(chǎn)
質(zhì)粒是天然存在于細菌中的環(huán)狀 DNA 分子，可以獨立于基因組 DNA 進行復(fù)制。 質(zhì)粒 DNA 在生物加工中發(fā)揮著重要作用，特別是在生物制藥應(yīng)用中，因為它涉及重組蛋白和病毒載體的生產(chǎn)。安必奇生物科技在利用大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)質(zhì)粒DNA方面經(jīng)驗豐富，可為醫(yī)藥公司、工業(yè)客戶提供從質(zhì)粒構(gòu)建、克隆篩選、菌種建庫、工藝開發(fā)、非臨床科研級質(zhì)粒生產(chǎn)到GMP級別質(zhì)粒生產(chǎn)的一站式個性化服務(wù)。
大腸桿菌重組蛋白表達生產(chǎn)
安必奇擁有多年的大腸桿菌重組蛋白表達經(jīng)驗，從蛋白性質(zhì)分析，有很多蛋白及其結(jié)構(gòu)域適合在大腸桿菌表達體系中表達。另外通過與 Sumo，Trx，GST 等標(biāo)簽融合也可以促進目的蛋白的表達及可溶表達。常見的表達產(chǎn)物包括毒性蛋白、生長因子、酶等，主要應(yīng)用于作為抗原制備抗體、參與細胞實驗與動物實驗、測定蛋白酶活、研究蛋白相互作用(免疫共沉淀，GST pull down)、蛋白結(jié)晶結(jié)構(gòu)研究、免疫組化實驗等。
| 大腸桿菌蛋白表達項目分析 | |
| 蛋白特性 | 蛋白的分子量大小，蛋白來源/物種，是否為毒性蛋白，蛋白翻譯后修飾程度， 蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度， 在細胞內(nèi)外的定位等 |
| 蛋白表達系統(tǒng) | 不同蛋白表達系統(tǒng)有不同的優(yōu)勢，如表達量高低，能否糖基化修飾等，結(jié)合蛋白應(yīng)用并全面考慮，選擇合適的蛋白表達系統(tǒng) |
| 蛋白表達需求量 | 不同下游應(yīng)用需求量有所區(qū)別，制備抗體需2 ~8mg，常規(guī)功能學(xué)研究10~200ug，細胞實驗或藥物研究則需更多 |
| 蛋白純化處理 | 蛋白純化標(biāo)簽主要有His、GST、SUMO、MBP等。His標(biāo)簽只有0.84kd，利于純化且對蛋白無影響，可以保留；其他屬于大標(biāo)簽，可以提高蛋白可溶性，但需要切除，否則會影響蛋白結(jié)構(gòu)功能。 |
| 服務(wù) | 服務(wù)內(nèi)容 | 時間 | 交付結(jié)果 |
| 大腸桿菌蛋白表達 | 密碼子優(yōu)化 基因合成&載體構(gòu)建 表達小試 放大表達&蛋白純化 蛋白質(zhì)檢 內(nèi)毒素去除服務(wù)(可選) | 4-6周 | 表達載體 3-5mg,> 90%純度蛋白；工業(yè)級別的蛋白量（可選） 質(zhì)檢報告 項目流程報告 內(nèi)毒素質(zhì)檢報告（可選） |
重組蛋白生產(chǎn)服務(wù)優(yōu)勢
成功交付上千種大腸桿菌體系重組表達蛋白，豐富的大腸桿菌重組表達資源，質(zhì)粒（pET系列，pET28a，pET30a，pET43.1a等 ；pGEX4T-1，pBAD24，pGADT7，pQE-30等）、菌株齊全（BL21 (DE3)、OrigamiB(DE3)、Rosetta(DE3)、 BL21 CodonPlus(DE3)、ESL等），多種表達條件優(yōu)化，增加可溶性蛋白表達量。
具備大腸桿菌表達可溶蛋白及體外復(fù)性蛋白 g 級生產(chǎn)能力。
大規(guī)模蛋白生產(chǎn)的平臺，發(fā)酵罐、高壓均質(zhì)機等設(shè)備齊全。
大腸桿菌化工原料生產(chǎn)
大腸桿菌可以用于生產(chǎn)各種代謝產(chǎn)物和化學(xué)物質(zhì)，如多肽、氨基酸、生物柴油、有機酸、多糖、抗生素等。大腸桿菌基因組改造可以發(fā)現(xiàn)新的特殊產(chǎn)物的基因，以及重要代謝過程和代謝產(chǎn)物生成相關(guān)的功能基因。安必奇生物提供定制化的大腸桿菌基因組編輯服務(wù)，優(yōu)化代謝通路，提升代謝產(chǎn)物產(chǎn)量，實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)多種化工原料。
服務(wù)案例
案例1：
將重組質(zhì)粒pET-SUMO-FGF21轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) 細胞中。5 mL Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基（1% 蛋白胨、1% 酵母提取物和0.5%氯化鈉pH 7.0，含有100 μg/mL氨芐青霉素），37°C 、250 r/min搖瓶培養(yǎng)包含重組質(zhì)粒的單克隆。過夜培養(yǎng)后，將 500 μL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至 50 mL 新鮮 LB 培養(yǎng)基中進行指數(shù)生長。通過SDS-PAGE分離SUMO-FGF21，使用密度計掃描測量融合蛋白的產(chǎn)量，經(jīng)過多個層析步驟回收高產(chǎn)率的重組質(zhì)粒。
案例2：
根據(jù)客戶的要求，利用大腸桿菌表達目的蛋白，并成功交付純化的蛋白和CoA。 QC數(shù)據(jù)如下：
PCR驗證
目的蛋白誘導(dǎo)表達
蛋白表達情況分析
目的蛋白純化
案例3：
在大腸桿菌內(nèi)構(gòu)建青蒿酸的生物合成途徑，通過生物合成青蒿酸，再通過體外化學(xué)合成得到青蒿素， 幾周內(nèi)便可大量生產(chǎn)青蒿素。使用可控的 100 立方米工業(yè)發(fā)酵罐，可以替代 5 萬畝的傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)種植生產(chǎn)青蒿素，顯著降低生產(chǎn)成本，具備低碳、綠色、環(huán)保的優(yōu)勢。
案例4：
在大腸桿菌中實現(xiàn)了VB12的從頭合成，首先解析VB12好氧合成路徑中鈷螯合與腺苷鈷啉醇酰胺磷酸的合成機理，將來源于5 種細菌中的28 個基因在大腸桿菌細胞中成功異源表達，并按其人工合成途徑劃分為5 個模塊進行人工途徑組裝，最終實現(xiàn)VB12的從頭合成，通過途徑優(yōu)化和發(fā)酵過程調(diào)控，產(chǎn)量達到307.00 μg/g 干細胞菌體，合成菌種發(fā)酵周期僅為工業(yè)生產(chǎn)菌株的1/10，具有工業(yè)應(yīng)用前景。
