到了二十世紀(jì)中葉，人們已經(jīng)知道蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，但不清楚如何將它們結(jié)合在一起的。它們是否以相似殘基的形式排列？還是隨機(jī)混合在一起？還是重復(fù)出現(xiàn)？有問(wèn)題出現(xiàn)就會(huì)去思考對(duì)應(yīng)的解決方法，大約在那個(gè)時(shí)候，人們?cè)O(shè)計(jì)出了一些方法為這些問(wèn)題提供了答案：每個(gè)蛋白質(zhì)的組成氨基酸殘基以一種獨(dú)特的順序線(xiàn)性排列。

Pehr Edman于1950年公布了一種蛋白質(zhì)測(cè)序方法——埃德曼降解法（Edman Degradation）。這種方法使得測(cè)定多肽或全蛋白的延伸序列成為可能，并被廣泛應(yīng)用到今天。該方法通過(guò)一系列的化學(xué)反應(yīng)來(lái)去除和識(shí)別多肽鏈末端的氨基酸殘基，即帶有游離α-氨基的殘基。同時(shí)，序列中的下一個(gè)殘基被制造出來(lái)，并經(jīng)受同樣一輪化學(xué)反應(yīng)。重復(fù)這一過(guò)程可以揭示多肽的序列。該方法為蛋白組學(xué)研究提供了工具。

埃德曼降解流程

主要分為耦合、切割、萃取、轉(zhuǎn)化、鑒定等幾個(gè)步驟。

1、耦合

異硫氰酸苯酯（PITC）在多肽鏈的N末端與a-氨基（或在脯氨酰殘基帶有亞氨基的情況下）反應(yīng)，形成末端殘基的苯硫代氨基甲酰基衍生物。該反應(yīng)建議在pH=8.0的堿性環(huán)境下進(jìn)行。通過(guò)上述描述可以看出，這個(gè)步驟需要游離的α-氨基。如果氨基已被修飾并且不再與PITC反應(yīng)，則該多肽被稱(chēng)為“受阻”。例如，許多蛋白質(zhì)被乙酰基、甲酰基或焦谷氨酰胺基阻斷。在沒(méi)有游離N末端的情況下，必須通過(guò)化學(xué)或酶促方法切割多肽以產(chǎn)生具有游離N末端的片段。在實(shí)際操作中，有必要避免樣品被含有胺的非多肽物質(zhì)污染，如trizma堿，因?yàn)檫@些物質(zhì)也可能與PITC發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生干擾后續(xù)分析的產(chǎn)物。

2、環(huán)化裂解

在強(qiáng)酸存在下，在第一個(gè)肽鍵處發(fā)生裂解，使肽(減去第一個(gè)殘基)和被釋放的第一個(gè)殘基形成苯胺噻唑啉酮(ATZ)形式。一旦其他反應(yīng)物和產(chǎn)物被沖走，縮短的多肽可以通過(guò)另一輪的耦合和裂解來(lái)釋放第二殘留，如此循環(huán)往復(fù)。目前，三氟乙酸(TFA)被用于這種裂解反應(yīng)。為了使多肽鏈內(nèi)各點(diǎn)的酸水解較小化，盡可能保證是在無(wú)水條件下進(jìn)行。以三氟乙酸（TFA）處理耦合后產(chǎn)物，將多肽或蛋白的N-端第一個(gè)肽鍵選擇性的切斷，釋放出該氨基酸殘基的噻唑啉酮苯胺衍生物。主要化學(xué)反應(yīng)如下：用TFA處理PITC修飾的肽會(huì)導(dǎo)致分子內(nèi)環(huán)化，其中PITC加合物的硫脲與第一個(gè)肽鍵的羰基成分反應(yīng)。 這種環(huán)化作用釋放出與第一個(gè)氨基酸綴合的PITC，形成一個(gè)新的N末端胺，同時(shí)保持ε-胺被封閉。

3、萃取、轉(zhuǎn)化

通過(guò)有機(jī)溶劑(乙酸乙酯或氯丁烷)的萃取，將ATZ殘基從肽中分離出來(lái)，在強(qiáng)酸性條件下轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的苯硫基乙內(nèi)酰脲（PTH）形式。一些修飾過(guò)的氨基酸殘基(如糖基天冬酰胺)在有機(jī)溶劑中溶解性差，因此在序列中相應(yīng)的位置出現(xiàn)空白。

4、PTH殘基分析

由Edman化學(xué)反應(yīng)的每個(gè)循環(huán)產(chǎn)生的PTH殘基通常由色譜法識(shí)別，最初是薄層色譜法，后來(lái)是反相高效液相色譜法。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品比較，依次鑒定和定量衍生自每個(gè)循環(huán)的PTH氨基酸殘基，并根據(jù)殘基從N端到C端的順序?qū)π蛄羞M(jìn)行描述。如果存在放射性氨基酸殘基，則可以通過(guò)此階段的活性來(lái)檢測(cè)它們。

圖1 利用埃德曼降解法進(jìn)行多肽的N端測(cè)序

埃德曼降解法的局限性：

• 如果N末端經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾，則將無(wú)法使用

• 如果遇到非α-氨基酸，測(cè)序?qū)⑼Ｖ?/p>

• 較大的蛋白質(zhì)無(wú)法通過(guò)Edman測(cè)序進(jìn)行測(cè)序

• 通常不能用于確定二硫鍵的位置

埃德曼降解法優(yōu)勢(shì)：

• 不需要樣品預(yù)處理

• 識(shí)別確切的N末端氨基酸

• 通過(guò)色譜法鑒定和定量釋放的氨基酸

• 使混合物中蛋白質(zhì)的n端測(cè)序成為可能

參考文獻(xiàn)：

• Smith J B. Peptide sequencing by Edman degradation. e LS, 2001.

• B?chor R, Kluczyk A, Stefanowicz P, et al. New method of peptide cleavage based on Edman degradation. Molecular diversity, 2013, 17(3): 605-611.