靶向蛋白組學(xué)定量

非靶向蛋白組學(xué)定量技術(shù)受限于生物樣本的復(fù)雜性，低豐度的多肽信號(hào)容易被高豐度的所抑制，因此難以檢測(cè)低豐度的多肽，靈敏度低且具有隨機(jī)性，定量的重復(fù)性也較低。隨著蛋白組學(xué)研究的深入，差異蛋白組學(xué)越來越受到人們的青睞，差異蛋白分析能發(fā)現(xiàn)潛在疾病標(biāo)志物，加快代謝組學(xué)的臨床應(yīng)用步伐。靶向蛋白組學(xué)定量（又被稱為目標(biāo)蛋白組學(xué)定量）技術(shù)可以彌補(bǔ)上述非靶向定量組學(xué)定量的不足，具有高通量、高準(zhǔn)確性、可重復(fù)性的優(yōu)點(diǎn)，基于早期的差異蛋白組/轉(zhuǎn)錄組/基因組的數(shù)據(jù)，在大生物樣本量中，驗(yàn)證這些標(biāo)志物。靶向蛋白組學(xué)定量主要包括MRM/SRM和PRM。靶向蛋白組學(xué)定量技術(shù)可用于信號(hào)傳導(dǎo)通路檢測(cè)、腫瘤標(biāo)志物研究和翻譯后修飾研究，是基于抗體的蛋白定量技術(shù)以外的另一種蛋白靶向定量技術(shù)。

1. MRM/SRM

多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（multiple reaction monitoring, MRM）在早期文獻(xiàn)中又被稱為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（selected reaction monitoring，SRM）。該技術(shù)本質(zhì)上是一種質(zhì)譜的掃描模式，基于目標(biāo)蛋白的特定母離子和子離子對(duì)，選擇采集符合目標(biāo)離子規(guī)則的信號(hào)，去除不符合規(guī)則的信號(hào)干擾，進(jìn)行高靈敏度、高準(zhǔn)確性和特異性的靶向蛋白定量。MRM質(zhì)譜分析主要包括三個(gè)階段：（1）一級(jí)質(zhì)譜掃描篩選出與目標(biāo)分子特異性一致的母離子;（2）碰撞碎裂母離子，去除干擾離子；（3）只采集來自選定的特異離子的質(zhì)譜信號(hào)。可以基于理論預(yù)測(cè)（如MRMpilot等軟件）或者真是實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇母子離子對(duì)。

圖1. 三重四極桿質(zhì)譜儀進(jìn)行MRM掃描示意圖。

該技術(shù)盡可能排除了其他離子的干擾影響，提高了靶向肽段的信噪比和對(duì)目標(biāo)肽段定性和定量檢測(cè)的靈敏度和可重復(fù)性，被認(rèn)為是基于質(zhì)譜技術(shù)的蛋白定量的，適合進(jìn)行標(biāo)志蛋白的高通量監(jiān)控。通過在樣本中加入已知含量的同位素標(biāo)記肽段作為內(nèi)參，MRM技術(shù)還可用于目標(biāo)蛋白的絕對(duì)定量。MRM技術(shù)可以和多種定量策略聯(lián)用，蛋白組學(xué)實(shí)驗(yàn)通常包含大量的分離富集步驟，因此越早加入內(nèi)標(biāo)能更好的降低實(shí)驗(yàn)誤差。另外MRM適合多種質(zhì)譜儀，如高分辨率質(zhì)譜儀（Q-TOF，orbitrap， FT-ICR，能區(qū)分ppm級(jí)別的質(zhì)量差異）和低分辨率質(zhì)譜儀如三重四極桿質(zhì)譜儀。

2. PRM

平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（parallel reaction monitoring, PRM）是MRM的衍生技術(shù)，也可在復(fù)雜生物樣品中同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)蛋白進(jìn)行相對(duì)或者絕對(duì)定量檢測(cè)。PRM采集目標(biāo)肽段的高分辨率MS2質(zhì)譜圖，使用軟件對(duì)ppm級(jí)別的目標(biāo)離子進(jìn)行峰面積抽提，排除其他離子的干擾。與MRM相比，動(dòng)態(tài)范圍更廣，精度更高靈敏度更強(qiáng)，重復(fù)性更好，抗背景干擾能力更強(qiáng)，實(shí)際操作更簡(jiǎn)單。PRM不需要預(yù)先根據(jù)目標(biāo)蛋白設(shè)計(jì)母離子和子離子對(duì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)子離子的掃描。PRM可替代Western blot技術(shù)，高通量地在大生物樣本量中驗(yàn)證抗體，并可應(yīng)用于多種非模式生物。

PRM主要包括五個(gè)實(shí)驗(yàn)流程：（1）從shotgun實(shí)驗(yàn)或者根據(jù)理論推測(cè)選擇靶向肽段；（2）制備樣品的混合物；（3）預(yù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整參數(shù)和靶向肽段；（4）PRM檢測(cè)；（5）數(shù)據(jù)分析。PRM方法的不足之處是當(dāng)待分析肽段的數(shù)量過大時(shí)，需要精細(xì)調(diào)整質(zhì)譜采集參數(shù)，否則會(huì)影響定量數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確和精度。2015年，Gallien和同事設(shè)計(jì)了一種內(nèi)標(biāo)觸發(fā)平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)(Internal standard triggered-parallel reaction monitoring，IS-PRM)，通過添加內(nèi)標(biāo)和實(shí)時(shí)調(diào)整采集參數(shù)來定量?jī)?nèi)源肽段，即使在分析大量肽段數(shù)據(jù)時(shí)也可使質(zhì)譜結(jié)果比較準(zhǔn)確。

圖2. SRM/MRM和PRM的實(shí)驗(yàn)流程對(duì)比圖。

SWATH/DIA

iTRAQ/TMT，SILAC，label free等蛋白定量方法都是基于數(shù)據(jù)依賴型采集（data-dependent acquisition，DDA）技術(shù)，在母離子選擇時(shí)，質(zhì)譜偏向于掃描高豐度肽段。SWATH是一種質(zhì)譜采集模式技術(shù)，它把數(shù)據(jù)非依賴采集（datain-dependent acquisition, DIA）和高分辨的靶向質(zhì)譜數(shù)據(jù)提取相結(jié)合，能對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行檢測(cè)和定量。SWATH在DIA模式下，能夠?qū)⑻囟ㄙ|(zhì)量范圍內(nèi)的前體離子打碎，采集碎片離子，并依次掃描相鄰的母離子寬口內(nèi)的碎片離子，獲得完整的肽段信息。

圖3. DDA、DIA和MRM的原理比較圖（DIA：隨機(jī)采集模式）。

一次SWATH實(shí)驗(yàn)就能獲得完整的蛋白定量和定性結(jié)果，無需方法優(yōu)化。高分辨率的模式可以消除背景干擾，提高選擇能力、靈敏度和通量，針對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)、微生物、細(xì)胞分泌物等樣本，SWATH的定量效果好。SWATH采集模式，不同于 MRM需要在數(shù)據(jù)采集前對(duì)目標(biāo)肽段做方法開發(fā)，它可以直接采集數(shù)據(jù)，形成的電子文檔，方便今后根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求挖掘更多的信息。利用免費(fèi)（OpenSWATH24, Skyline25, PeakView）或者商用的軟件（Spectronaut）和蛋白組特定的方法庫，SWATH可以提高定量通量。SWATH主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)組定量、蛋白復(fù)合體鑒定和宿主蛋白分析等。

參考文獻(xiàn)：

• 基于質(zhì)譜的定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)展現(xiàn)狀[J]. 生物技術(shù)通報(bào), 2017(9).

• Rosenberger G, Koh C C, Guo T, et al. A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS[J]. Scientific Data, 2014, 1:140031.

• 章申燕. mTRAQ/MRM定量技術(shù)在AKR家族分析中的應(yīng)用[D]. 2013.

• Gallien S, Kim S Y, Domon B. Large-scale targeted proteomics using internal standard triggered-parallel reaction monitoring (IS-PRM)[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2015, 14(6): 1630-1644.