雜交瘤技術(shù)又稱為單克隆抗體技術(shù)（monoclonal antibody technique），顧名思義其主要用于制備單克隆抗體。雜交瘤細胞系的建立主要由三個關(guān)鍵步驟組成，分別為動物免疫，細胞融合，雜交瘤篩選。
雜交瘤細胞是具有分泌特異性抗體的B淋巴細胞與具有增殖能力的骨髓瘤細胞融合，通過無性繁殖形成的細胞系。因此首先需要獲得兩個親本細胞，這是建立雜交瘤細胞系的前提。
動物免疫獲得免疫B淋巴細胞
要獲得能夠分泌特異性抗體的B淋巴細胞就需要用抗原對動物進行免疫。
抗原：制備抗體的抗原在種類上幾乎沒有限制，具有抗原性質(zhì)的物質(zhì)都可以制備單克隆抗體。在免疫動物的過程中，我們常常將抗原分為2種類型：可溶性抗原如蛋白質(zhì)，核酸等；顆粒性抗原如病毒，細菌，細胞等。一般顆粒性抗原都具有較強的免疫原性，可以不加佐劑，而可溶性蛋白抗原在免疫時需要添加佐劑，以獲得良好的免疫效果。
動物免疫
（1）動物的選擇 目前常用的免疫動物為來自BALB/c小鼠和Lou大鼠以制備小鼠單克隆抗體和大鼠單克隆抗體。
（2）免疫方法：常用的免疫方法有以下三種
體內(nèi)免疫法：通常指皮下，肌肉及腹腔免疫，多適用于各種顆粒性抗原和可溶性抗原。一般顆粒性抗原細胞的用量為2×107，且不需要加佐劑；可溶性抗原用量一般情況下不超過100μL，并需要加適宜的免疫佐劑。
體外免疫法：從脾臟或者外周血分離B淋巴細胞在體外與抗原共同培養(yǎng)。此方法多用于制備單克隆抗體，如乙肝疫苗基礎(chǔ)免疫后，取人外周血分離B淋巴細胞與乙肝表面抗原共同培養(yǎng)，制備人抗乙肝單抗。
脾內(nèi)免疫法：借助外科手術(shù)暴露動物的脾臟，將抗原直接注入脾臟。此方法一般需抗原量少，適用于一些來源有限且昂貴的抗原免疫。
（3）免疫過程：
可溶性抗原加佐劑后，皮下多點注射，至少三點以上，基礎(chǔ)免疫一般4-6周，同劑量抗原加強免疫后，于融合前3-4天，靜脈加強。
顆粒性抗原基礎(chǔ)免疫2-3周，間隔一周加強免疫，2-3次，于融合前3-4天用相應(yīng)抗原靜脈加強后取脾B淋巴細胞用于融合。
骨髓瘤細胞的選擇
要取得良好的細胞融合效果，所用的雜交瘤細胞必須處于良好的生理狀態(tài)，處于對數(shù)生長期的瘤細胞較好。細胞數(shù)低于104/mL 時，細胞生長緩慢，一般在104-5×105/mL 時呈對數(shù)生長，此時細胞渾圓透亮，大小均一，排列整齊。當細胞密度超過106/mL 以上時，細胞停止分裂，細胞發(fā)暗，皺縮。因此一般細胞傳代選擇(1-5)×105/mL的濃度，且融合時活細胞數(shù)至少應(yīng)該大于90%。
一株好的骨髓瘤細胞株應(yīng)該具備以下幾個特點：1）穩(wěn)定，易培養(yǎng)；2）自身不分泌免疫球蛋白；3）融合率高；4）屬于HGPRT缺陷株，便于HAT培養(yǎng)基篩選雜交瘤細胞。
表1 常見的骨髓瘤親本細胞
細胞融合
在獲得兩個親本細胞以后需要對其融合，以獲得B淋巴細胞-骨髓瘤細胞雜合體。細胞融合是指在自然或者人工條件下使得兩個或兩個以上細胞合并為一個細胞的過程。雖然細胞在體外培養(yǎng)條件下可能會自發(fā)融合，但是概率極低，因此需要借助外界誘導方法促進細胞融合。
誘導細胞融合的方法有生物法，化學法和物理法。
生物法：如紫外滅火的仙臺病毒誘導細胞融合，其可以大大提高融合概率，在病毒類融合劑中有效，適用廣泛。
化學法：目前應(yīng)用廣泛的有聚乙二醇。其易得，簡便，融合效果也穩(wěn)定。
物理法：電融合
雜交瘤細胞篩選
1）雜交瘤細胞選擇
細胞融合會產(chǎn)生三種融合細胞：B淋巴細胞與B淋巴細胞融合體，骨髓瘤與骨髓瘤細胞融合體，第三種就是需要篩選出來的B淋巴細胞與骨髓瘤的雜合體。
采用HAT培養(yǎng)基培養(yǎng)雜交瘤細胞，在該培養(yǎng)基中只有骨髓瘤細胞與B淋巴細胞的雜合體才能存活并無限增殖。為此，在接種96孔板培養(yǎng)時，加入一定量的HAT培養(yǎng)液，經(jīng)過1-2周的培養(yǎng)，雜交瘤細胞被選擇培養(yǎng)出來。
2）特異性抗體篩選
初步篩選出來的雜交瘤細胞并不一定都能分泌特異性抗體，因此還需要進一步對這些雜合體進行篩選。目前實驗室常用的是酶聯(lián)免疫法，也就是將抗原固相在微孔板上，細胞培養(yǎng)上清一定時間后，用酶標記的抗鼠二抗，通過酶促底物的顏色變化了解是否存在針對該抗原的特異性抗體。該方法簡便易行且可大規(guī)模操作，所以目前實驗室都廣泛采用此方法。
更多請參考《雜交瘤篩選—選擇培養(yǎng)基篩選》 《雜交瘤篩選—特異性抗體篩選》
雜交瘤細胞克隆建株
在細胞融合初期，雜交瘤細胞的染色體常有丟失的現(xiàn)象，甚至導致其喪失分泌特異性抗體的功能。因此，在篩選抗體陽性的雜交瘤細胞時，應(yīng)盡早進行克隆化，以保持雜交瘤細胞具有同源的子代。常見的方法有很多，比如有限稀釋法（limiting dilution method）、軟瓊脂法（soft agar method）、單細胞顯微操作法（single cell micromanipulation method）和熒光激活細胞分類儀（fluorescence activated cell sorter）。
更為詳細的內(nèi)容請見《雜交瘤細胞克隆方法》
雜交瘤細胞一經(jīng)建立應(yīng)盡快凍存，保證雜交瘤細胞不會被污染或變異。因此，必須在得到分泌特異性抗體的雜交瘤細胞后的早期，保存幾批細胞于液氮中，以便在發(fā)生意外時可以將其復(fù)蘇，繼續(xù)進行實驗。
相關(guān)服務(wù)