蛋白質(zhì)是組成人體細胞、組織的重要成分，新的蛋白質(zhì)多肽要轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒斓鞍踪|(zhì)，需要經(jīng)過蛋白翻譯后修飾。翻譯后修飾包括:磷酸化、糖基化、甲基化、羥基化、脂酰化、羧基化等共價修飾。其中蛋白質(zhì)磷酸化是重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾之一。
蛋白翻譯后修飾的類型
蛋白質(zhì)磷酸化由蛋白質(zhì)激酶所催化，磷酸化多發(fā)生在多肽鏈絲氨酸，蘇氨酸的羥基上，偶爾也發(fā)生在酪氨酸殘基上（磷酸化分子式如圖2），這種磷酸化的過程受細胞內(nèi)一種蛋白激酶催化，磷酸化后的蛋白質(zhì)可以增加或降低它們的活性，例如：促進糖原分解的磷酸化酶，無活性的磷酸化酶b經(jīng)磷酸化以后，變成有活性的磷酸化酶a。而有活性的糖原合成酶I經(jīng)磷酸化以后變成無活性的糖原合成酶D，共同調(diào)節(jié)糖原的合成與分解。
磷酸化分子式
在20世紀50年代以來，蛋白質(zhì)磷酸化一直被生物學(xué)家看作是一種動態(tài)的生物調(diào)節(jié)過程。磷酸化涉及細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)活動、肌肉收縮以及細胞的增殖、發(fā)育和分化等生理病理過程，在細胞中，大約有1/3的蛋白質(zhì)被認為是經(jīng)過磷酸化修飾的。由激酶催化的磷酸化和由磷酸酶催化的去磷酸化是控制細胞周期的關(guān)鍵。細胞周期調(diào)控途徑由一系列激酶和磷酸酶組成，它們通過將途徑的下一個底物磷酸化和去磷酸化而對外來信號和檢驗點做出反應(yīng)。
蛋白激酶催化的蛋白質(zhì)磷酸化反應(yīng)
磷酸化和去磷酸化就像一個分子開關(guān)。一些蛋白平時處于失活狀態(tài)，被激酶磷酸化之后才可以發(fā)揮活性，進一步轉(zhuǎn)導(dǎo)各種生命過程。而有些正好相反，某些蛋白磷酸化時是失活的，經(jīng)過磷酸酶去磷酸化才可以激活。
將靶蛋白磷酸化使之激活或者失活
因此，蛋白質(zhì)磷酸化的分析和磷酸化位點的鑒定已成為目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究的關(guān)注點之一。以下簡要介紹幾種常用的檢測蛋白質(zhì)磷酸化的方法。
1.westernblot
檢測蛋白磷酸化狀態(tài)的常用方法是western blot，過程是先用SDS-PAGE分離生物樣品，接著轉(zhuǎn)移到膜上，最后利用磷酸化特異的抗體來鑒定目的蛋白。典型的Western blot實驗步驟避免了使用放射性同位素時的危險品和廢物處理要求。磷酸化特異抗體大多靈敏，可檢測常規(guī)樣品中的磷酸化蛋白。
2.酶聯(lián)免疫吸附分析(ELISA)
ELISA的定量能力比Western blot，有助于研究激酶活性調(diào)節(jié)及其功能。這種微孔板形式的分析一般是利用目的蛋白特異的捕獲抗體，和磷酸化狀態(tài)無關(guān)。隨后讓目的蛋白結(jié)合在抗體包被的分析板中，加入待分析的磷酸化位點特異的檢測抗體。這些分析通常設(shè)計為顯色或熒光檢測。產(chǎn)生的信號強度與最初樣品中存在的磷酸化蛋白的濃度成正比。
3.激酶活性分析
蛋白激酶通常是多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)的常見組分，它們影響了很多負責生物反應(yīng)的下游效應(yīng)物，因此，評估某個特定激酶的活性可能為平行通路提供寶貴信息。生物學(xué)樣品中的激酶活性通常是在體外測定的，在ATP的存在下將免疫沉淀的激酶與外源底物共同孵育。之后通過一些報告系統(tǒng)來評估特定激酶對底物的磷酸化，包括顯色、放射性或熒光檢測。
4.磷酸化特異抗體的開發(fā)
20世紀90年代，科學(xué)家利用合成的磷酸化肽段來免疫兔子，開發(fā)出多個磷酸化狀態(tài)特異抗體，這些磷酸化肽段代表了目標蛋白磷酸化位點周圍的氨基酸序列。之后將免疫血清上樣到肽段親和柱中，產(chǎn)生高度特異的免疫試劑 。磷酸化特異抗體的出現(xiàn)為傳統(tǒng)方法的改進以及新的免疫分析技術(shù)的開發(fā)打開了大門。在相關(guān)技術(shù)中使用磷酸化特異抗體都要注意，成功的檢測依賴于抗體與目的磷酸化蛋白的特異性和親和力。
5.細胞內(nèi)流式細胞術(shù)和ICC/IHC
通過流式細胞術(shù)和ICC來檢測磷酸化蛋白要求蛋白穩(wěn)定，且抗體能夠接近。細胞通常經(jīng)過刺激，并由甲醛或多聚甲醛來固定，以交聯(lián)磷酸化蛋白，使其穩(wěn)定，便于分析。固定后的細胞經(jīng)過透化處理，讓磷酸化特異抗體能夠進入細胞。對于不同的亞細胞定位，通常使用不同的透化技術(shù)。
6.質(zhì)譜
復(fù)雜的生物樣品中蛋白質(zhì)磷酸化的評估對于了解基于磷酸化的信號網(wǎng)絡(luò)很重要。復(fù)雜的蛋白混合物中大規(guī)模的磷酸化蛋白分析包括磷酸化蛋白和磷酸化肽段的鑒定，以及磷酸化殘基的測序。質(zhì)譜(MS)技術(shù)是進行這些研究的有力工具。
磷酸化修飾調(diào)控了廣泛的細胞活性，包括細胞周期、分化、代謝和神經(jīng)元通訊等，對于磷酸化的檢測比較重要，以上列出了幾種常用的檢測蛋白磷酸化的方法，每種方法有其各自的優(yōu)缺點，研究人員需根據(jù)實驗設(shè)計挑選合適的方法。
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