酵母是一類包括釀酒酵母和非常規酵母在內的多種單細胞真菌的總稱，天然酵母資源具有豐富的生物多樣性和功能多樣性。隨著高通量篩選技術方法的進步，大量高效的酵母遺傳元件已被開發利用，不同酵母底盤也被更廣泛應用，酵母基因組編輯技術和染色體工程技術也已趨于成熟，酵母生理代謝調控的機理認識也更深入，工業上已利用酵母構建高效的細胞工廠，進行生物煉制、生產高值產品等。

安必奇擁有成熟的重組表達和純化技術，配備了不同規格的發酵罐，以及高密度微生物發酵技術平臺，滿足不同的產量要求。我們可以構建和篩選酵母底盤，進行發酵工藝開發，包括基礎培養基篩選、補料培養基優化及篩選，評估和優化關鍵發酵工藝參數、建立控制策略，還能實現大規模的下游純化，純化方法包括親和純化、離子交換、分子篩、疏水和反相等。

平臺設施

發酵生產用酵母菌株

? 畢赤酵母

畢赤酵母（Pichia pastoris）表達系統是近年來發展迅速、應用廣泛的一種真核表達系統。它是甲醇營養型酵母菌，有兩個乙醇氧化酶（Alcohol oxidase, AOX）編碼基因AOX1和AOX2，兩種序列相似，AOX1基因嚴格受甲醇誘導和調控。當甲醇為唯一碳源時，AOX1啟動子可被甲醇誘導，啟動乙醇氧化酶的表達，從而用甲醇進行代謝，含AOX1啟動子的質粒可用來促進編碼外源蛋白的目的基因的表達。工業上常用其進行外源蛋白的誘導表達。利用畢赤酵母可以進行高密度發酵生產單細胞蛋白。

畢赤酵母表達系統的優勢：

• 含有特有的強有力的AOX（醇氧化酶基因）啟動子，用甲醇可嚴格地調控外源基因的表達。

• 培養成本低，產物易分離，畢赤酵母所用發酵培養基成本合理，一般碳源為甘油或葡萄糖及甲醇，其余為無機鹽，培養基中不含蛋白，有利于下游產品分離純化。

• 外源蛋白基因遺傳穩定，外源基因能以高拷貝數整合到畢赤酵母基因組中，不易丟失并能得到高表達菌株。

• 作為真核表達系統，畢赤酵母具有真核生物的亞細胞結構，具有糖基化、脂肪酰化、蛋白磷酸化等翻譯后修飾加工功能，可實現胞內表達和胞外分泌表達兩種形式。

? 釀酒酵母

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）也是應用較多的重要工業微生物，廣泛應用于生物醫藥、食品、輕工和生物燃料生產等不同生物制造領域。釀酒酵母能夠進行高密度發酵，安全可靠。啟動子位于結構基因5'端上游區，是RNA聚合酶的結合區。啟動子區的結構影響其與RNA聚合酶的親和力，進而影響基因的轉錄表達效率。通過對啟動子改造，篩選強啟動子，可以構建釀酒酵母的高效表達系統。

酵母發酵服務

安必奇提供酵母菌種全面的構建和發酵生產服務。我們可以從客戶提供的DNA或蛋白質序列開始，到交付出高產量、高品質且穩定的菌種庫，以及滿足不同應用需求的終產物。

? 菌株構建

定制化構建酵母基因工程菌株（基因優化、表達質粒構建、陽性菌株篩選、高拷貝菌株篩選、工程菌株優化），得到的高產菌株易于進行工業化發酵，生產能力強，可以降低生產成本，提高經濟效益。

? 發酵優化

發酵條件的優化（培養基及補料優化，溶氧量、溫度、pH值控制）
大規模發酵生產

? 純化工藝優化

通過疏水、親和、凝膠過濾色譜、離子交換等純化方式可獲得純度大于95%的目標蛋白。

? 凍干工藝優化

凍干過程包括三個階段：（1）冷凍階段，（2）初級干燥階段和（3）二次干燥階段。對多種條件下冷凍干燥試驗過程中的關鍵參數進行優化，在不影響凍干制品質量的前提下（保證低的水分含量、具備優良的產品外觀），縮短凍干工藝的周期。

酵母發酵服務優勢

安必奇擁有豐富的蛋白表達經驗，開發了抗體、高糖基化修飾蛋白、酶等品種技術，酵母表達體系成熟，可從基因優化、酵母工程菌株的篩選、表達質粒的構建，以及小試條件探索到放大發酵條件優化的完整試驗能力。自主改造的高表達質粒，也已成功應用于酵母表達體系，能夠為客戶提供高質量、定制化的技術服務。

酵母發酵應用

畢赤酵母在藥物和制藥領域成功表達了融合蛋白M-IL-2(⁸⁸Arg、¹²⁵Aia)、S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)、人體干擾素α2b、白細胞介素-II、C型溶菌酶Lyzl6等，在食品酶制劑領域中成功表達了果糖酶等，在飼料領域成功表達了植酸酶、木聚糖酶、β葡聚糖酶等，其中有些產品已實現商品化和產業化。天然釀酒酵母菌株不僅應用于食品和酒精類產品的發酵，也能生產燃料乙醇，還能利用合成生物學技術對釀酒酵母進行改造合成天然產物，實現穩定可持續的生產和調控合成，例如生產阿片類藥物、天然維生素E類化合物等。

服務案例

案例1：

使用巴斯德畢赤酵母菌株高效表達肌紅蛋白（基因 ID：397467，編碼豬肌紅蛋白 MB 基因）。

? 巴斯德畢赤酵母表達宿主選擇
使用 Pichia X33、Pichia KM71、Pichia SMD1168 或 Pichia GS115 作為宿主。
畢赤酵母基因組中的 ku70 基因 (GeneID:8199462) 通過 CRISPR/Cas9 系統被敲除。
巴斯德畢赤酵母基因組中敲除一種或多種主要降解重組蛋白的蛋白酶基因，例如pep4 (GeneID:8200047)、yps1-1 (GeneID:8196641)和prb1 (GeneID:8196728)。
基因工程菌株為X33-Δku70-Δyps1-1-MB菌株。

? 表達載體選擇
pPICZ alpha A、pPICZ alpha B、pPICZ alpha C 或 pPIC9K

? 促進溶解的標簽選擇
TrxA、Sumo、GST、MBP、TF 或 NusA

? 發酵系統優化
發酵培養基包括但不限于YNB、YPD、BMM或BMMY培養基
發酵時間（48h）
分泌表達和下游純化（His-Tag 蛋白純化）

? 發酵產物驗證